帐号
密码
验证  6641 
 ·导航分类               
技术推广
  视频文件
  科研成果
  标准规范
  种植技术
 ·专家在线             
暂无留言信息
 ·网站调查        
   您对我们的意见
  扩大栏目覆盖范围
  增加现有栏目内容
  精简内容提高质量
  改善网站相关功能
  
美国千赢国际娱乐老虎机组培中材料灭菌的研究
关闭窗口|打印本页|浏览:5060 |添加时间:2007-9-19
摘 要:采用不同的灭菌措施,包括不同的灭菌剂、浓度和处理顺序,对美国千赢国际娱乐老虎机带芽茎段进行灭菌处理,研究其污染率和污染速率的变化,寻找建立无菌培养系最适宜的方法。结果表明,外植体材料最适宜的灭菌处理方法为:先将外植体在70%酒精中浸30s,再将其用0.2%升汞液(加数滴吐温80)浸15min,无菌水冲洗10次,最后接种。培养基中添加适量活性炭,且前期暗培养是提高材料无菌率的有利保障。另外,培养基中加入青霉素、链霉素各100mg•L-1可明显提高材料的无菌率。
关键词:美国千赢国际娱乐老虎机;无菌培养系;污染率



美国千赢国际娱乐老虎机(CaryaillinoensisK Koch)又名薄壳千赢国际娱乐老虎机,为胡桃科千赢国际娱乐老虎机属落叶乔木,其树形高大,树姿优美,树冠开展,材质优良,是很好的城乡绿化树种,又是世界上重要的干果树种,坚果壳薄易剥,核仁肥厚,富含脂肪,味香甜,为干果食用及榨油的原料。美国千赢国际娱乐老虎机于1900年左右引入我国,先后在江苏的江阴、南京,浙江的杭州,福建的莆田等地栽植。引种范围较广,北到北京,南至海南岛,但以江苏、浙江、福建和安徽等地引种较多[1]。随着国民经济的发展,人民生活水平的提高,美国千赢国际娱乐老虎机的开发利用价值已被越来越多的人们所认识,市场需求量日益增加,栽培面积不断扩大。美国千赢国际娱乐老虎机传统的繁殖方法以播种繁殖为主,但是播种实生苗15年后才能正常结果,由播种至结果苗龄所需的时间漫长,给栽培者造成很大压力,从而影响了人们栽植千赢国际娱乐老虎机的积极性。而且实生繁殖不易保持其品种的优良特性。对于嫁接扦插等无性繁殖虽然进行了多种有益的实践和探讨,但始终未能有效应用于生产[2,3]。为了扩大美国千赢国际娱乐老虎机优良品种的栽植面积,缩短育苗至结果期的时间,作者以美国千赢国际娱乐老虎机为试材,进行了组培快繁技术的研究。由于美国千赢国际娱乐老虎机枝干及芽鳞的表面密布绒毛,粘附的尘埃及菌物较多,给组培快繁工作造成很大障碍。为了突破初代培养污染的困境,建立美国千赢国际娱乐老虎机无菌培养系,为其后的继代增殖,试管苗培养打下良好的基础,以美国千赢国际娱乐老虎机盛果期大树树冠上方带芽嫩茎段为试材,进行了无菌培养系建成过程中消毒灭菌措施的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

美国千赢国际娱乐老虎机当年生幼嫩的带芽茎段。

1.2 方法

选取结果大树树冠上方生长健壮的当年生新梢,取顶端前3个芽,每个带芽茎段长约2cm。首先将外植体用洗衣粉饱和溶液上清液精刷一遍,再用流动清水冲洗12h,用滤纸吸干外植体表面水分后,采用不同方法对外植体进行灭菌处理。在参考前人对核桃外植体灭菌方法的基础上[4],作者对灭菌药剂的种类、药剂浓度、处理时间以及处理程序等进行了细致的设计和筛选,共设计了13组不同的灭菌措施。将相同的外植体材料经不同的灭菌方式处理后,经过重切茎端之后接种于相同的培养基中(1/2MS+2%糖+0 6%琼脂),置于相同的条件下培养[(25±2)℃、光照12h•d-1,光强1500~2000lx]。每两天调查记录1次材料污染情况,经过2周的培养后统计接种材料的灭菌效果和无菌率,从而筛选出效果最佳的灭菌措施。

美国千赢国际娱乐老虎机外植体灭菌措施与程序为:

第1组:70%酒精30s,2%次氯酸钠10min,0 1%升汞10min,2 5mg•L-1(青霉素+链霉素)30min。

第2组:70%酒精30s,2%次氯酸钠10min,2 5mg•L-1(青霉素+链霉素)30min,0 1%升汞(加入4~5滴吐温80)10min。

第3组:70%酒精30s,2%次氯酸钠5min,0 1%升汞7min,2 5mg•L-1(青霉素+链霉素)25min。

第4组:70%酒精20s,2%次氯酸钠5min,2 5mg•L-1(青霉素+链霉素)25min,0 1%升汞(加入4~5滴吐温80)10min。

第5组:70%酒精30s,0 1%升汞15min。

第6组:70%酒精30s,0 2%升汞10min。

第7组:70%酒精30s,2%次氯酸钠5min,2 5mg•L-1(青霉素+链霉素)20minmin。

第8组:70%酒精30s,2%次氯酸钠5min,0 2%升汞8min,2 5mg•L-1(青霉素+链

第9组:70%酒精30s,0 8mg•L-1(青霉素+链霉素)30min,0 2%升汞15min。第10组:70%酒精30s,2%次氯酸钠8min,0 8mg•L-1(青霉素+链霉素)30min。

第10组:70%酒精30s,2%次氯酸钠8min,0 8mg•L-1(青霉素+链霉素)30min。

第11组:70%酒精30s,0 2%升汞15min,培养基中加入0 2%活性碳,前1周暗培养。

第12组:70%酒精30s,0 8mg•L-1(青霉素+链霉素)30min,0 2%升汞15min(加入4~5滴吐温80),培养基中添加100mg•L-1(青霉素+链霉素)。

第13组:70%酒精30s,0 2%升汞15min(加入4~5滴吐温80),培养基中添加100mg•L-1(青霉素+链霉素)。

2 结果与分析

2.1 灭菌措施对外植体灭菌效果的影响

由表1可看出,经过不同的灭菌措施处理的接种材料,其灭菌效果差异明显。其中灭菌效果最好的是第11组,材料无菌率达到95%,其方法是:先将外植体用70%酒精浸30s,再将其用0.2%升汞液浸15min,无菌水冲洗10次后接种;并且在培养基中添加0.2%的活性炭,前1周进行暗培养。其次是第12组,材料无菌率为91%,其方法是:先将外植体在70%酒精浸30s,再用青霉素0.8mg•L-1+链霉素0.8mg•L-1的混和液浸30min,最后用0.2%升汞液(加数滴吐温80)浸15min,无菌水冲洗10次后接种。而第3组、第4组灭菌效果最差,材料全部被污染,无菌率为0;第2组和第10组的灭菌效果也很差,无菌率只有9%和5.5%。

2.2 灭菌措施对外植体菌类侵染的抑制效果

各种不同灭菌措施对菌类的抑制能力如表2所示。在设计的13组灭菌措施中以第11组表现出对材料上菌类的滋生侵染的抑制效果最强,接种培养后第9d才出现1个材料被污染,污染率占5%;其后直至第15d观测结束之日也未见新增污染材料,无菌材料污染率能较稳定的控制在5%的水平。其次,抑制菌类滋生效果较好的是第12组和第13组。第12组虽然累计污染率较低,为9%,仅次于第11组,但接种后第3d便出现首例污染材料,占4.5%,但这例污染属于培养基污染,也是操作的失误。其后抑制菌类滋生比较稳定,至第13d又新增1例污染,累计污染率9%。第13组接种培养后第9d出现1例污染材料,占3.4%,其后连续发生3例污染,第15d时,污染率达13.8%。而对材料菌类滋生抑制效果最差的是第3组及第4组,第5d开始出现污染,其后污染率急剧攀升,很快全部被污染,这2组的处理措施对菌物的抑制能力极差,至第15d时已100%被污染。第10组和第2组处理措施的抑菌效果较差,均由第5d开始出现污染,其后污染瓶数急剧上升,经2周培养后分别为94.4%和90.9%的污染率。

2.3 抗生素及灭菌程序对材料灭菌效果的影响

根据第12、13组灭菌措施的比较,2组培养基的添加成分完全相同,第12组采用了青、链霉素混合液灭菌程序,而第13组未采用青、链霉素处理程序,其他灭菌药剂、浓度、处理时间均相同。结果表明,第12组材料灭菌效果略优于第13组,说明青、链霉素对美国千赢国际娱乐老虎机外植体灭菌有一定的积极作用,但差异不太显著。又据第9组与第11组的灭菌效果比较,青、链霉素的使用并未见消毒效果有明显提高,反而不如培养基中添加活性炭,前期暗培养降低光强及温度更有利于提高灭菌效果。

第1组和第2组相比较,材料灭菌的药剂完全相同,浓度及处理时间也相同只是处理顺序有所不同,第1组先用升汞溶液浸,再用青、链霉素浸;而第2组则先用青、链霉素浸,再用升汞溶液浸,结果2组表现出了不同的灭菌效果。由表1可看出,第1组材料无菌率略高于第2组。说明用升汞液处理之后再用青、链霉素处理,效果略好。由表2所列数据也说明了同样的论点。

第9组和第12组相比较,材料药剂、浓度、处理顺序完全相同,只是培养基的添加成分略有不同,第12组的培养基中添加了青、链霉素各100mg•L-1,第9组的培养基中未添加任何抗生素。由表1可看出2组培养材料的无菌率明显不同,第9组为42%,第12组为91%,可见培养基中添加一定量的青、链霉素对材料的灭菌效果明显优于用青、链霉素浸泡材料的灭菌效果。

2.4调查数据分析

灭菌措施对外植体灭菌效果统计数据经卡方检验:χ2=52.4331,P<0.0001,处理总效应达到显著水平。进一步进行卡方的分割分析表明,第11、12、13组与第2、3、4组差异显著,第11组与第1组、第8组差异显著(P〈0.05),其余组差异不显著(P>0.05)。说明第11、12、13组对材料灭菌效果显著,而第1、2、3、4、8、10组对材料灭菌效果差,与前文分析结果一致。

灭菌措施对外植体菌类抑制效果的方差分析表明,处理组与观察天数的总效应均达到显著水平(P〈0 05)。对各种灭菌措施多重比较表明,处理组11、12、13与2、3、4差异显著,达到5%水平。其余组差异不显著(P>0 05)。说明第11、12、13组对外植体菌类抑制效果显著,而第2、3、4组对外植体菌类抑制效果差,这与前文分析结果一致。

3小结与讨论

根据上述的研究结果,对美国千赢国际娱乐老虎机组培中无菌培养系建立的具体技术措施总结如下:
对美国千赢国际娱乐老虎机外植体灭菌效果最佳的处理措施:外植体→70%酒精浸30s→0 2%升汞液浸15min→无菌水冲洗10次→接种。且培养基中添加0 2%活性炭,前期暗培养。材料无菌率最高,达95%,材料污染率最低,且对材料上的菌类滋生抑制能力最强。此组灭菌措施宜于提倡和应用。

上述最佳灭菌措施之所以具有较强的杀菌效力是由于采用了较高浓度的升汞液,而且由于前期暗培养具有减弱光照、降低培养温度的作用,从而有利于抑制菌类的滋生。

青霉素和链霉素混合液浸泡外植体有一定的灭菌效果,但效果不甚显著,不宜提倡。如果使用青、链霉素灭菌处理,则宜在升汞液处理之后再用青、链霉素灭菌处理,效果略好。

在培养基中添加适量的青、链霉素对菌类滋生的抑制效果更优于用青、链霉素混合液浸泡材料的灭菌效果。


参考文献:
[1]楼炉焕 观赏树木学[M] 北京:中国农业出版社,2000
[2]钱林等 千赢国际娱乐老虎机嫁接新技术[J] 浙江林业,1995(2):17
[3]汪祥顺等 千赢国际娱乐老虎机嫁接技术研究[J] 林业科技通讯,1997(2):30~32
[4]刘兰英 “薄壳香”核桃组培中的褐化及防止措施研究[J] 园艺学报,2002,29(2):171~172
[5]刘青林等 花卉组织培养[M] 北京:中国农业出版社,2002
[6]刘兰英 核桃的组织培养和快繁[J] 植物生理学通讯,2000,36(5):434~435
[浙江农林大学][浙江教育网]
     
主办单位:浙江千赢国际娱乐老虎机产业协会  千赢国际娱乐老虎机官网|千赢国际娱乐老虎机官方网站千赢国际娱乐老虎机省级区域科技创新服务中心 承办单位 浙江农林大学天则千赢国际娱乐老虎机科技开发有限公司
著作权和商标声明 | 法律声明 | 服务条款 | 客服电话:0571—63741127
千赢国际娱乐老虎机_千赢国际娱乐老虎机官网|千赢国际娱乐老虎机官方网站版权所有浙 浙ICP备10051440号 2003-2010