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千赢国际娱乐老虎机成花机理及激素调控研究(实施方案)
关闭窗口|打印本页|浏览:7736 |添加时间:2007-9-19

    一、取材

取样:前期对所需采样的千赢国际娱乐老虎机标准树进行挂牌,确定取样的枝条和花芽的数目等,然后于花芽分化的前期每隔7天在树冠中部外围预先固定的标准枝上采集新梢样芽,每次采集30-50个芽,芽位于新梢中上部,发育正常。在千赢国际娱乐老虎机花芽分化之前,根据确定的标准枝方法进行采样;在千赢国际娱乐老虎机花芽分化之后,则可以根据大小基本一致的可见花芽进行采样。早上9:00-11:00作为取样时间,从3月16日开始,3月26日,4月2日,4月6日,4月10日,4月14日,4月17日,4月22日,共8次。
采后分为四部分:一部分用戊二醛固定,进行电子扫描;一部分用FAA固定,室内做石蜡切片,进行显微观察,同时观察不同时期、不同分化阶段芽的形态,分析花芽分化阶段及其历程;一部分用80%甲醇进行固定,用于内源激素的测定;一部分进行液氮低温保存,用于生理生化测定和基因表达分析。

二、基因表达分析

?)总RNA提取:用CTAB法及热酚法分别提取雌花芽总RNA。
(2)重要基因的全长cDNA的克隆
对与花芽分化密切相关的克隆,根据木本植物中已克隆的基因同源区中保守氨基酸残基或DNA序列设计引物,进行RT-PCR扩增方法得到全长cDNA。
RT-PCR方法如下:
cDNA的逆转录第一链合成:
50ul体系
—Oligo (dT)18 (25ng/ul) , 2.5 ul;
—RNA(1.7-2 ug/ul) , 3.0 ul;
—加DEPC水到 32ul;
—65℃ 保温 5min;
—冰上冷却 10 min;
—100mM DTT(终浓度为 10 m M ), 5ul ;10 mM dNTP(终浓度1mM ), 5ul;10× RT buffer , 5ul;RNA 抑制剂(40u), 1ul;MMLV 逆转录酶(200u/ul), 2ul ; 42 ℃,60min
— 92℃,4min,使逆转录酶失活;
— -20℃保存备用。
— 10× RT buffer:500 mM Tris-HCI, pH 8.3 / 30 mM MgCl2 / 750 mM KCl
— 100mM DTT:15.4mg, 1ml DEPC H2O
 PCR扩增
— 50ul体系
1×system V
—10×PCR buffer 5.0 ul
— U-primer(20mM) 0.5 ul
— L-primer (20mM) 0.5 ul
— dNTP( 2.5 mM /each) 2.0 ul
— Tag (5u/ul) 0.2 ul
— ddH2O 41.3ul
— 模板 5 ul / 0.5 ul
— Total 50 ul
2 assay, 前6项先混合,离心6S;后加不同浓度模板,离心6S;(加一滴矿物油,可不加)。按[94℃-4 min /(94℃- 1 min / 52℃- 1 min / 72℃-1.5 min)35 cycle / 72℃-7 min / 4℃]扩增。
 PCR产物检测:0.4g琼脂糖,50ml 0.5%TBE; 微波炉溶解冷却后加1ul EB,灌制 5 mm胶,50-100V,15-30min。

(3)cDNA-AFLP法获得成花相关未知基因
具体方法如下:
1. mRNA纯化
使用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Spin-Column,流程如下:
⑴ ≤250µg RNA 移入1.5ml离心管中,加入DEPC水至总体积为250l,混匀;
⑵ 加入250µl的缓冲液OBB和15µl的Oligotex悬浮液,混匀;
⑶ 样品在70℃的bl℃k上温浴3min,以破坏RNA的二级结构;
⑷ 把样品放在室温(20~30℃)下10min,使Oligotex颗粒上oligo dT和RNA的polyA尾巴充分杂交;
⑸ 在最大离心力(14000~18000g)下离心2min,使Oligotex:mRNA 复合体沉淀下来,小心地移去上清液,离心管中留有约50l的上清液以防止Oligotex树脂的流失;
⑹ 加入400l的缓冲液OW2,涡旋或用枪头悬浮Oligotex:mRNA,并把悬浮液移入一带1.5ml离心管的悬转柱中,最大离心力(14000~18000g)离心1min;
⑺ 把悬转柱移到另一1.5ml离心管中,柱中央加入400l的缓冲液OW2,在最大离心力(14000~18000g)下离心1min,弃去过滤液;
⑻ 把悬转柱移到另一1.5ml离心管中,放在70℃的bl℃k上,往柱中加入50l的热(70℃)缓冲液OEB,用枪头打3至4次悬浮树脂,最大离心力(14000~18000g)下离心1min;
⑼ 把悬转柱连同离心管重新放在70℃的bl℃k 上,再次加入50l的热(70℃)缓冲液OEB,用枪头打3至4次,重新悬浮树脂,最大离心力(14000~18000g)离心1min,得到100l的mRNA液;
⑽ 比色杯用0.1mol/L NaOH 浸泡30min,依次用1mmol/L EDTA的DEPC清洗。对照用50l OEB,测定OD值;
⑾ 真空干燥,加无RNase水3μl溶解;所得mRNA 可放在-20~-70℃下保存2~3年。
2. 双链cDNA的合成
用SMARTTM cDNA library construction kit合成(用约1g的mRNA进行cDNA合成)。
2.1第一链cDNA合成:
① 向灭过菌的0.5ml微量离心管中加入下列试剂:
1l polyA+RNA样品(1g的mRNA)
1l SMART III Oligonucleotide
1l CDS III/3’ PCR Primer
加水补足至5l,混合样品,短暂离心。
② 72℃保温2min,迅速置于冰上冷却2min。短暂离心收集样品于管底。
③ 加入下列试剂于反应管中:
2l 5×First-Strand Buffer
1l DTT(20mmol/L)
1l dNTP Mix(10mmol/L)
1l MMLV逆转录酶(200U/l)
加水补足至10l,用移液枪轻轻吹吸样品,短暂离心收集样品。
④ 42℃温浴1h(如用PCR仪保温,样品上要加一滴矿物油),将反应管置于冰上终止第一链反应。
⑤ 加1l的NaOH,68℃下30min。
⑥ 如不直接进行第二链反应,第一链cDNA存于-20℃,可保存三个月。
2.2第二链cDNA合成:
采用LD-PCR扩增法
① 预热PCR仪到95℃。
② 加入以下试剂于反应管中:
11l 第1链cDNA
71l 去离子水
10l 10×Advantage 2 PCR buffer
2l 50×dNTP Mix
2l 5’PCR Primer
2l CDSIII/3’ PCR Primer
2l 50×Advantage 2 Polymerase Mix
100l 混合样品,短暂离心收集样品于管底。
③PCR:加两滴矿物油,分成两管,将反应管置于预热好的PCR仪上。
72℃ 10min
95℃ 1min
3 cycles:
95℃ 15sec
68℃ 8min
④检测:循环结束后,取出5l样品在1.1%琼脂糖凝胶上电泳,检测合成情况。
3. 用QIAquick PCR Purification Kit纯化cDNA
① 往PCR产物中加入5倍体积PB,用手弹匀。
② 把QIAquick 悬转柱放在2ml的收集管上。
③ 把前面混好的样品移入QIAquick 悬转柱上,室温放置2min,使DNA充分结合。10000g或13000rpm离心30~60sec。
④ 弃去上清液,把QIAquick柱放回原收集管中;
⑤ 加入750µl的PE清洗,13000rpm离心30~60sec;
⑥ 弃去上清,把QIAquick柱重新放回原管,最大离心速度离心1min;
⑦ 把QIAquick柱放在一干净的离心管上;
⑧ 加入50µl的EB于柱中央,室温下放置1~2min,13000rpm离心1min,洗脱。
⑨ 以EB作为空白,测OD值。
4. cDNA酶切
4.1 TaqI酶切:
Xl cDNA(约200ng)
0.3l TaqI(12U,40U/l)
4l 10×RL buffer
Yl H2O
40l
65℃水浴2h。
4.2 AseI酶切:
在TaqI酶切体系中添加:
1l 10×RL buffer
1l AseI(10U,10U/l)
8l H2O
50l
37℃水浴2h。
4.3连接
在酶切体系中加入:
1l 接头1(TaqI接头:取25g T1和22g T2定容到100l)
1l 接头2 (AseI接头:取2.6g A1和2g A2定容到100l)
0.5l 10mmol/L ATP
0.5l 10×RL buffer
0.2l T4 DNA连接酶 (5U/l)
2l H2O
55l
37℃水浴3h。
5. 预扩增:
1l 连接产物
1l 引物T3(100ng/l)
1l 引物A3(100ng/l)
5l 10×PCR buffer
1.25l dNTP(10mM)
0.25l Taq酶(1U,5U/l)
40.5l H2O
50l
PCR [94℃:30 sec,52℃:30 sec,72℃:60 sec]×15循环。
5l 产物于1.8%琼脂糖胶上电泳检测。
PCR产物稀释20倍,用于选择性扩增。
6. 选择性扩增:
4l 预扩增稀释产物
3l 特异性引物1(30ng,10ng/l)
3l 特异性引物2(30ng,10ng/l)
2l 10×PCR buffer
0.5l dNTP(10mmol/L)
0.125l Taq酶(1U,5U/l)
7.4l H2O
20l
PCR条件:
94℃ 30sec
65℃ 30sec [-0.7℃/cycle]
72℃ 1min
94℃ 30sec
56℃ 30sec
72℃ 1min
72℃ 7min
7. 配制测序胶
⑴ 玻璃板清洗:玻璃板用洗洁精洗3次,双蒸水冲洗,晾干后用无水乙醇擦洗,晾干。短板用新鲜配制的Binding solution(3l Bind silicone加入到1ml 95% 的乙醇和5l冰醋酸)涂抹一遍,4~5min后,95%乙醇擦一遍;长板用约0.5ml的Sigmacote(25l sigmacote加入到475l氯仿中)涂抹一遍,5~10min 后,95%的乙醇擦一遍。晾干后,用0.4mm厚的胶条将玻璃板装配好,用胶带纸将边缘封好。
⑵ 配胶:80ml 6%聚丙烯酰胺胶
5×TBE 16ml
尿素 33.6g
40%Acr:Bis贮液 12ml
ddH2O 24ml
灌胶前加40ml TEMED和400l 10%过硫酸铵(AP),混匀。
⑶ 灌胶:将玻璃板呈40度倾斜放置,将配好的丙烯酰胺溶液从低处连续灌入,灌胶速度保持连续、均匀,防止气泡出现。平放后倒插入梳子,聚合2小时,冲洗掉板上残留物,擦干。
8. 测序胶电泳
① 将玻璃板装在电泳槽上,并在上下槽分别加500ml 的1×TBE缓冲液,在60W下预电泳20~30min;
② 选择性扩增产物加等量的上样缓冲液,于94℃变性5min,立即置于冰上;
③ 用1ml移液枪冲洗胶表面沉积的尿素,装上梳子(刚碰上胶为好),上样3l;
④ 2000V、60W电泳2h,溴酚蓝指示剂至底线;
⑤ 卸下玻璃板,揭开短板。
9. 测序胶银染
1)固定:固定/终止液(1.8L ddH2O中加200ml冰醋酸)中轻摇20min,至指示剂消失,回收1升固定液备用;
2)洗胶:ddH2O漂洗3次,每次2min,滴干水10~20sec;
3)染色:染色液(2g AgNO3和3ml 37%甲醛溶于2L ddH2O)中轻摇30min,ddH2O漂洗,快且完全;
4)显色:1L预冷的显色液(60g Na2CO3溶于2L ddH2O,冰浴至10℃,用之前加3ml的37%甲醛和400l浓度为10mg/ml的NaS2O3)中到条带出现,转入另1L预冷的显色液至所有的条带出现;
5)固定:1L固定液加入显色液中,摇床上2~3min;
6)洗涤、晾干:ddH2O冲洗2次,每次2min,室温晾干。

(4)重要基因的表达、调控研究
以上述cDNA克隆为探针,对不同花芽分化时间提取的不同器官mRNA 进行杂交,分析基因的表达特征,从分子水平上探讨激素影响千赢国际娱乐老虎机成花的机制,以及芽对激素感受的分子机制。

三、栽培处理及化学调控

分别在枝条表面涂抹不同配比、不同浓度的激素溶液,同时配合进行施肥、拉枝等栽培技术措施,明确它们对千赢国际娱乐老虎机内源激素的影响;观察不同花芽在不同激素浓度处理下的分化情况,选择合适的激素种类和浓度。

三因素试验:栽培措施设拉枝、不拉枝二个水平,分别用L1、L2表示;TIBA涂干设50、100、300 mg/L三个水平,分别用T1、T2、T3表示;PP333喷施设50、250、500 mg/L三个水平,分别用P1、P2、P3表示。设置三个区组。

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