一、取材

取样：前期对所需采样的千赢国际娱乐老虎机标准树进行挂牌，确定取样的枝条和花芽的数目等，然后于花芽分化的前期每隔7天在树冠中部外围预先固定的标准枝上采集新梢样芽，每次采集30-50个芽，芽位于新梢中上部，发育正常。在千赢国际娱乐老虎机花芽分化之前，根据确定的标准枝方法进行采样；在千赢国际娱乐老虎机花芽分化之后，则可以根据大小基本一致的可见花芽进行采样。早上9:00-11:00作为取样时间，从3月16日开始，3月26日，4月2日，4月6日，4月10日，4月14日，4月17日，4月22日，共8次。
采后分为四部分：一部分用戊二醛固定，进行电子扫描；一部分用FAA固定，室内做石蜡切片，进行显微观察，同时观察不同时期、不同分化阶段芽的形态，分析花芽分化阶段及其历程；一部分用80%甲醇进行固定，用于内源激素的测定；一部分进行液氮低温保存，用于生理生化测定和基因表达分析。

二、基因表达分析

?）总RNA提取：用CTAB法及热酚法分别提取雌花芽总RNA。
（2）重要基因的全长cDNA的克隆
对与花芽分化密切相关的克隆，根据木本植物中已克隆的基因同源区中保守氨基酸残基或DNA序列设计引物，进行RT-PCR扩增方法得到全长cDNA。
RT-PCR方法如下：
cDNA的逆转录第一链合成：
50ul体系
—Oligo (dT)18 (25ng/ul) , 2.5 ul；
—RNA(1.7-2 ug/ul) , 3.0 ul；
—加DEPC水到 32ul；
—65℃ 保温 5min；
—冰上冷却 10 min；
—100mM DTT（终浓度为 10 m M ）, 5ul ;10 mM dNTP（终浓度1mM ）, 5ul；10× RT buffer , 5ul；RNA 抑制剂（40u）, 1ul；MMLV 逆转录酶（200u/ul）, 2ul ; 42 ℃，60min
— 92℃,4min,使逆转录酶失活;
— -20℃保存备用。
— 10× RT buffer：500 mM Tris-HCI, pH 8.3 / 30 mM MgCl2 / 750 mM KCl
— 100mM DTT:15.4mg, 1ml DEPC H2O
 PCR扩增
— 50ul体系
1×system V
—10×PCR buffer 5.0 ul
— U-primer(20mM) 0.5 ul
— L-primer (20mM) 0.5 ul
— dNTP( 2.5 mM /each) 2.0 ul
— Tag (5u/ul) 0.2 ul
— ddH2O 41.3ul
— 模板 5 ul / 0.5 ul
— Total 50 ul
2 assay, 前6项先混合，离心6S；后加不同浓度模板，离心6S；(加一滴矿物油,可不加)。按[94℃-4 min /(94℃- 1 min / 52℃- 1 min / 72℃-1.5 min)35 cycle / 72℃-7 min / 4℃]扩增。
 PCR产物检测：0.4g琼脂糖，50ml 0.5%TBE; 微波炉溶解冷却后加1ul EB，灌制 5 mm胶，50-100V,15-30min。

（3）cDNA-AFLP法获得成花相关未知基因
具体方法如下：
1. mRNA纯化
使用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Spin-Column，流程如下：
⑴ ≤250µg RNA 移入1.5ml离心管中，加入DEPC水至总体积为250l，混匀；
⑵ 加入250µl的缓冲液OBB和15µl的Oligotex悬浮液，混匀；
⑶ 样品在70℃的bl℃k上温浴3min，以破坏RNA的二级结构；
⑷ 把样品放在室温(20～30℃)下10min，使Oligotex颗粒上oligo dT和RNA的polyA尾巴充分杂交；
⑸ 在最大离心力(14000～18000g)下离心2min，使Oligotex:mRNA 复合体沉淀下来，小心地移去上清液，离心管中留有约50l的上清液以防止Oligotex树脂的流失；
⑹ 加入400l的缓冲液OW2，涡旋或用枪头悬浮Oligotex:mRNA，并把悬浮液移入一带1.5ml离心管的悬转柱中，最大离心力(14000～18000g)离心1min；
⑺ 把悬转柱移到另一1.5ml离心管中，柱中央加入400l的缓冲液OW2，在最大离心力(14000～18000g)下离心1min，弃去过滤液；
⑻ 把悬转柱移到另一1.5ml离心管中，放在70℃的bl℃k上，往柱中加入50l的热(70℃)缓冲液OEB，用枪头打3至4次悬浮树脂，最大离心力(14000～18000g)下离心1min；
⑼ 把悬转柱连同离心管重新放在70℃的bl℃k 上，再次加入50l的热(70℃)缓冲液OEB，用枪头打3至4次，重新悬浮树脂，最大离心力(14000～18000g)离心1min，得到100l的mRNA液；
⑽ 比色杯用0.1mol/L NaOH 浸泡30min，依次用1mmol/L EDTA的DEPC清洗。对照用50l OEB,测定OD值；
⑾ 真空干燥，加无RNase水3μl溶解；所得mRNA 可放在-20～-70℃下保存2～3年。
2. 双链cDNA的合成
用SMARTTM cDNA library construction kit合成（用约1g的mRNA进行cDNA合成）。
2.1第一链cDNA合成：
① 向灭过菌的0.5ml微量离心管中加入下列试剂：
1l polyA+RNA样品(1g的mRNA)
1l SMART III Oligonucleotide
1l CDS III/3’ PCR Primer
加水补足至5l，混合样品，短暂离心。
② 72℃保温2min，迅速置于冰上冷却2min。短暂离心收集样品于管底。
③ 加入下列试剂于反应管中：
2l 5×First-Strand Buffer
1l DTT（20mmol/L）
1l dNTP Mix（10mmol/L）
1l MMLV逆转录酶（200U/l）
加水补足至10l，用移液枪轻轻吹吸样品，短暂离心收集样品。
④ 42℃温浴1h（如用PCR仪保温，样品上要加一滴矿物油），将反应管置于冰上终止第一链反应。
⑤ 加1l的NaOH，68℃下30min。
⑥ 如不直接进行第二链反应，第一链cDNA存于-20℃，可保存三个月。
2.2第二链cDNA合成：
采用LD-PCR扩增法
① 预热PCR仪到95℃。
② 加入以下试剂于反应管中：
11l 第1链cDNA
71l 去离子水
10l 10×Advantage 2 PCR buffer
2l 50×dNTP Mix
2l 5’PCR Primer
2l CDSIII/3’ PCR Primer
2l 50×Advantage 2 Polymerase Mix
100l 混合样品，短暂离心收集样品于管底。
③PCR：加两滴矿物油，分成两管，将反应管置于预热好的PCR仪上。
72℃ 10min
95℃ 1min
3 cycles:
95℃ 15sec
68℃ 8min
④检测：循环结束后，取出5l样品在1.1%琼脂糖凝胶上电泳，检测合成情况。
3. 用QIAquick PCR Purification Kit纯化cDNA
① 往PCR产物中加入5倍体积PB，用手弹匀。
② 把QIAquick 悬转柱放在2ml的收集管上。
③ 把前面混好的样品移入QIAquick 悬转柱上，室温放置2min，使DNA充分结合。10000g或13000rpm离心30～60sec。
④ 弃去上清液，把QIAquick柱放回原收集管中；
⑤ 加入750µl的PE清洗，13000rpm离心30～60sec；
⑥ 弃去上清，把QIAquick柱重新放回原管，最大离心速度离心1min；
⑦ 把QIAquick柱放在一干净的离心管上；
⑧ 加入50µl的EB于柱中央，室温下放置1～2min，13000rpm离心1min，洗脱。
⑨ 以EB作为空白，测OD值。
4. cDNA酶切
4.1 TaqI酶切：
Xl cDNA（约200ng）
0.3l TaqI（12U，40U/l）
4l 10×RL buffer
Yl H2O
40l
65℃水浴2h。
4.2 AseI酶切：
在TaqI酶切体系中添加：
1l 10×RL buffer
1l AseI（10U，10U/l）
8l H2O
50l
37℃水浴2h。
4.3连接
在酶切体系中加入：
1l 接头1（TaqI接头：取25g T1和22g T2定容到100l）
1l 接头2 （AseI接头：取2.6g A1和2g A2定容到100l）
0.5l 10mmol/L ATP
0.5l 10×RL buffer
0.2l T4 DNA连接酶 （5U/l）
2l H2O
55l
37℃水浴3h。
5. 预扩增：
1l 连接产物
1l 引物T3（100ng/l）
1l 引物A3（100ng/l）
5l 10×PCR buffer
1.25l dNTP（10mM）
0.25l Taq酶（1U，5U/l）
40.5l H2O
50l
PCR [94℃：30 sec，52℃：30 sec，72℃：60 sec]×15循环。
5l 产物于1.8%琼脂糖胶上电泳检测。
PCR产物稀释20倍，用于选择性扩增。
6. 选择性扩增：
4l 预扩增稀释产物
3l 特异性引物1（30ng，10ng/l）
3l 特异性引物2（30ng，10ng/l）
2l 10×PCR buffer
0.5l dNTP（10mmol/L）
0.125l Taq酶（1U，5U/l）
7.4l H2O
20l
PCR条件：
94℃ 30sec
65℃ 30sec [-0.7℃/cycle]
72℃ 1min
94℃ 30sec
56℃ 30sec
72℃ 1min
72℃ 7min
7. 配制测序胶
⑴ 玻璃板清洗：玻璃板用洗洁精洗3次，双蒸水冲洗，晾干后用无水乙醇擦洗，晾干。短板用新鲜配制的Binding solution（3l Bind silicone加入到1ml 95% 的乙醇和5l冰醋酸）涂抹一遍，4～5min后，95%乙醇擦一遍；长板用约0.5ml的Sigmacote（25l sigmacote加入到475l氯仿中）涂抹一遍，5～10min 后，95%的乙醇擦一遍。晾干后，用0.4mm厚的胶条将玻璃板装配好，用胶带纸将边缘封好。
⑵ 配胶：80ml 6%聚丙烯酰胺胶
5×TBE 16ml
尿素 33.6g
40%Acr:Bis贮液 12ml
ddH2O 24ml
灌胶前加40ml TEMED和400l 10%过硫酸铵(AP)，混匀。
⑶ 灌胶：将玻璃板呈40度倾斜放置，将配好的丙烯酰胺溶液从低处连续灌入，灌胶速度保持连续、均匀，防止气泡出现。平放后倒插入梳子，聚合2小时，冲洗掉板上残留物，擦干。
8. 测序胶电泳
① 将玻璃板装在电泳槽上，并在上下槽分别加500ml 的1×TBE缓冲液，在60W下预电泳20～30min；
② 选择性扩增产物加等量的上样缓冲液，于94℃变性5min，立即置于冰上；
③ 用1ml移液枪冲洗胶表面沉积的尿素，装上梳子（刚碰上胶为好），上样3l；
④ 2000V、60W电泳2h，溴酚蓝指示剂至底线；
⑤ 卸下玻璃板，揭开短板。
9. 测序胶银染
1）固定：固定/终止液（1.8L ddH2O中加200ml冰醋酸）中轻摇20min，至指示剂消失，回收1升固定液备用；
2）洗胶：ddH2O漂洗3次，每次2min，滴干水10～20sec；
3）染色：染色液（2g AgNO3和3ml 37%甲醛溶于2L ddH2O）中轻摇30min，ddH2O漂洗，快且完全；
4）显色：1L预冷的显色液（60g Na2CO3溶于2L ddH2O，冰浴至10℃，用之前加3ml的37%甲醛和400l浓度为10mg/ml的NaS2O3）中到条带出现，转入另1L预冷的显色液至所有的条带出现；
5）固定：1L固定液加入显色液中，摇床上2～3min；
6）洗涤、晾干：ddH2O冲洗2次，每次2min，室温晾干。

（4）重要基因的表达、调控研究
以上述cDNA克隆为探针，对不同花芽分化时间提取的不同器官mRNA 进行杂交，分析基因的表达特征，从分子水平上探讨激素影响千赢国际娱乐老虎机成花的机制，以及芽对激素感受的分子机制。

三、栽培处理及化学调控

分别在枝条表面涂抹不同配比、不同浓度的激素溶液，同时配合进行施肥、拉枝等栽培技术措施，明确它们对千赢国际娱乐老虎机内源激素的影响；观察不同花芽在不同激素浓度处理下的分化情况，选择合适的激素种类和浓度。

三因素试验：栽培措施设拉枝、不拉枝二个水平，分别用L1、L2表示；TIBA涂干设50、100、300 mg/L三个水平，分别用T1、T2、T3表示；PP333喷施设50、250、500 mg/L三个水平，分别用P1、P2、P3表示。设置三个区组。